Посев экссудата производят в чашки Петри с сывороточным агаром, содержащим антибиотики ристомицин или линкомицин для подавления кожной флоры. Из остатка экссудата готовят препараты-мазки. Мазки из содержимого петехий можно приготовить в виде отпечатков. Для этого стерильной петлей осторожно скарифицируют поверхность петехий, затем прикладывают несколькими местами предметное стекло (стерильное), фиксируют пламенем горелки, окрашивают. На основании данных микроскопии возможна выдача предварительного ответа.

Засеянные чашки инкубируют при +370С 24 часа (в случае отсутствия роста - 48 часов); подозрительные на менингококки колонии отсевают и изучают по описанной схеме (п. 3).

Бактериологическое исследование носоглоточной слизи на менингококк

1-й день исследования

Исследуемый материал - слизь с задней стенки глотки - берут натощак или через 3 - 4 часа после еды стерильным ватным тампоном, укрепленным на изогнутой проволоке.

Материал берут с обязательным надавливанием шпателем на корень языка. Тампон вводят концом кверху за мягкое небо в носоглотку и проводят 2 - 3 раза по задней стенке. При извлечении тампон не должен касаться зубов, слизистой щек, языка и язычка.

Материал может быть засеян на месте его взятия на чашку Петри с питательной средой, или средой обогащения, или взят смоченным тампоном, который затем доставляют в лабораторию. При посеве на чашку материал втирают на поверхности небольшого участка (1*2 см) среды всеми сторонами тампона, затем этим же тампоном засевают штрихами (с отрывом) по всей площади, отведенной для посева.

Используют сывороточный агар с добавлением в него антибиотиков, подавляющих рост грамположительных кокков. Для этой цели применяется ристомицин или линкомицин в оптимальной концентрации. На одну чашку можно засеять две пробы. Однако встречаются отдельные штаммы менингококков, более чувствительные к линкомицину, поэтому те же пробы одновременно засевают на половину чашки с сывороточным агаром без линкомицина.

При отсутствии линкомицина или ристомицина можно использовать диски с этими антибиотиками. Диски (не более 2-х) накладывают непосредственно на поверхность засеянного сывороточного агара. В этом случае на 1 чашку сеют только одну пробу. Через одни сутки вокруг диска, в зоне 1 см, рост грамположительной флоры будет подавлен, что увеличивает возможность выделения колоний нейссерий.

Засеянные чашки доставляют в лабораторию, тщательно защищая их от охлаждения, в зимнее время применяют грелки (+35 - +400С) и немедленно помещают в термостат при +370С.

Тампоны с исследуемым материалом, погруженные в полужидкую или транспортную среду, доставляют в лабораторию, также тщательно защищенными от охлаждения. Тампоны в 0,1% полужидком агаре (обогащения) помещают в термостат для подращивания флоры.

Смоченные тампоны или тампоны в транспортной бульонной среде засевают на чашку с сывороточным агаром, лишенным ингибитора, без предварительного подращивания. Посев делают отжатым тампоном. Засеянные чашки помещают в термостат.

При транспортировке материала на короткое расстояние (1 - 2 часа езды до лаборатории) применение транспортных сред не рекомендуется. При транспортировке в течение 2 - 4 часов уместно применение тампонов, смоченных питательной средой. При транспортировке в течение 3-х часов и более тампоны перевозят, погруженными в транспортную среду.

Полужидкая среда обогащения может использоваться независимо от сроков транспортировки.

2-й день исследования

Просматривают чашки, засеянные накануне, визуально и под лупой-микроскопом МБС, подозрительные колонии отсевают на секторы чашки с сывороточным агаром (не менее 3 - 5 колоний). На средах с ингибиторами вырастают только грамотрицательные бактерии, преимущественно представители нейссерий. При отсутствии роста в чашках с антибиотиками проводят повторный просмотр их через 40 - 48 часов после посева. В эти же сутки делают высев из полужидкой (0,1%) среды обогащения на чашку с сывороточным агаром без ингибитора.

3-й день исследования

Изучают рост чистых культур, отсеянных из отдельных колоний в предыдущий день. Культуры, колонии которых имеют желтый пигмент различной интенсивности, а также характеризующиеся "сухим" ростом, отбрасывают. Следует иметь в виду, что на сывороточном агаре колонии менингококков могут выглядеть желтоватыми из-за оттенка среды. Поэтому для обнаружения пигмента их необходимо просматривать при дневном освещении.

Для дальнейшего исследования на менингококки оставляют только непигментированные культуры, дающие нежный влажный рост. Из них готовят мазки, проводят микроскопию чистой культуры. В первых генерациях для менингококков характерны полиморфизм и вариабельность окраски, что не наблюдается у непатогенных нейссерий. После микроскопии дальнейшую идентификацию культур проводят по выше описанным тестам.

Если рост культуры из отсеянных колоний достаточно обильный, то в эти сутки ставят реакцию агглютинации с группоспецифическими сыворотками.

4-й день исследования

Просматривают посевы, сделанные в предыдущий день. Учитывают результаты роста на бессывороточном и желчном агаре (при +370С), сахаролитическую активность, ставят реакцию с водным раствором Люголя на продукцию полисахарида, проводят окончательную серологическую идентификацию менингококков по реакции агглютинации.

В этот же день выдают окончательный положительный или отрицательный ответ. Результаты бактериологического исследования с полужидкой среды, соответственно, будут получены на сутки позднее.

Исследование трупного материала

Патологоанатомическое вскрытие желательно проводить в наиболее ранние сроки после смерти. Для бактериологического исследования направляют кровь, ликвор, кусочки головного мозга (или гной, взятый тампоном с мягкой мозговой оболочки, в случаях менингококцемии - из печени, селезенки, легкого, надпочечников и т.д.). Кровь берут стерильно из правого сердца, после вскрытия скальпелем, с помощью стерильной пипетки с грушей в количестве 7 - 10 мл. Из них 2 - 3 мл засевают в 25 мл 0,1% полужидкого агара, а оставшиеся – 5 - 7 мл используют для других исследований (серологических, в ВИЭФ и т.д,). Для посевов можно использовать, также сгустки крови из крупных сосудов.

Ликвор берут стерильной пипеткой из около оболочечного пространства (во время извлечения головного мозга из полости черепа), в стерильную пробирку в количестве 3 - 5 мл и немедленно высевают на чашки с питательными средствами. В количестве 0,1 мл исследуемый материал наносят в центр чашки и распределяют по ее поверхности покачиванием, растирать шпателем не рекомендуется.

Надо иметь в виду, что рост на чашках может быть смешанным из-за попадания непатогенной микрофлоры, поэтому к общепринятому набору питательных сред следует добавить чашку сывороточного агара с антибиотиком (ристомицин, линкомицин).

Гной с мозговых оболочек берут стерильным ватным тампоном и засевают газоном или штрихами на чашки с шоколадным сывороточным агаром и в пробирку со средой обогащения, делают 2 мазка на предметных стеклах, один из которых красят метиленовым синим, другой - по Граму.

Для взятия материала из мозга и других органов к месту разреза прикасаются раскаленным шпателем, материал берут из глубины разреза стерильным ватным тампоном. Посев производят обычным способом на те же плотные и жидкие питательные среды.

Помимо посевов из мозга, целесообразно проводить изучение мазков-отпечатков с поверхности мягких мозговых оболочек. После подсушивания и фиксации над пламенем горелки (при длительном хранении - в ацетоне) мазки окрашивают и просматривают.

Методы серологической идентификации менингококков или их антигенов

Реакция агглютинации в полистироловых пластинах

При постановке реакции агглютинации (РА) используют полистироловые пластины или большие стекла. Для каждой испытуемой культуры менингококков используют один ряд лунок пластины. Число горизонтальных лунок соответствует числу агглютинирующих группоспецифических сывороток. Жидкую сыворотку каждой серогруппы в лунке разводят вдвое (1 капля сыворотки + одна капля взвеси культуры). В отдельной лунке каждого ряда готовят взвесь испытуемых культур. Для этого запаянной изогнутой пастеровской пипеткой бактериальную массу снимают с чашки Петри и тщательно эмульгируют в физиологическом растворе. Для получения оптимальной рабочей густоты к взвеси добавляют по 1,0 мл физиологического раствора. Взвесь разносят по 1 капле в горизонтальные лунки.

Пластины встряхивают в течение 1 мин. руками или шуттеле-аппарате. Учитывают реакцию в течение первых 3-х минут. Контролем служит лунка, в которой готовят исходную взвесь бактерий в физиологическом растворе.

Реакция микропреципитации для определения серогруппы менингококков

В чашку Петри или стеклянную пластинку размером 9 * 12 см наливают 20 мл, а на предметное стекло - 5 мл расплавленного 1% агара на физиологическом растворе. В застывшем агаре с помощью металлических трубок просекают отверстия (лунки) диаметром 3 мм, из которых агаровые пробки удаляют путем отсоса этой же трубкой или острием иглы. Расстояние между центрами лунок 0,5 см. Лунки в агаре располагают следующим образом: в центральную лунку пастеровской пипеткой наливают сыворотку, в периферические - прогретые при +1000С в течение 15 минут взвеси испытуемых культур. Микробную кипяченую взвесь можно хранить в холодильнике в течение 2-х недель. Для реакции микропреципитации используют не разведенные сыворотки.

Концентрация испытуемой суточной культуры менингококка, выращенной на 20% сывороточном агаре, должна составлять 30 - 60 единиц, т.е. быть в 3 - 6 раз гуще оптического стандарта мутности в 10 единиц. Чашки Петри или стеклянные пластины с лунками, заполненными сывороткой и антигенами, помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) на 24 - 48 часов при +20 - +220С. По окончании срока учитывают реакцию. Реакция проявляется только со штаммами менингококков гомологичной серогруппы в виде линии преципитации.

Метод ВИЭФ

У больного гнойным менингитом, желательно до применения химиотерапии, берут СМЖ, которую исследуют на присутствие специфического полисахаридного антигена. Для этого используют аппарат для иммуноэлектрофореза ПЭФ-3 или другой любой марки. В аппарат заливают "камерный" веронал-мединаловый буфер, содержащий в 1 л дистиллированной воды 21,9 г мединала и 3,45 веронала (веронал надо греть на водяной бане до полного его растворения) рН = 8,6. Приготовленный 1% агар, растопленный и остуженный до +600С, наносят в количестве 20 мл на поверхность стеклянной пластинки, размером 9 * 12 см, помещенную на горизонтальный столик. После застывания агара пробойником или металлической трубкой, диаметр которой равен 3 мм, высекают 2 параллельных ряда отверстий на расстоянии 3 мм друг от друга, по числу групповых сывороток. Ряды располагают перпендикулярно к направлению силы тока.

Антисыворотки вносят в лунки, расположенные со стороны анода (+), а спинномозговую жидкость в лунки со стороны катода (-).

Сыворотку вносят в отдельную лунку. В отдельную лунку помещают заведомо положительный контроль, который позволяет оценить правильность постановки теста. В качестве контроля используют менингококковую вакцину серогруппы А или С с гомологичной сывороткой, в концентрации 10 - 20 мкг/мл. Приготовленную пластинку помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 20 - 30 мин. при силе тока 12 - 15 МА на 1 стекле. Аппарат работает при комнатной температуре. При положительной реакции через 10 мин. после выключения тока, между лунками (с одной из сывороток и ликвором) появляются линии преципитации, которые хорошо видны в проходящем свете. В случае, когда антигена мало, линии преципитации проявляются на следующие сутки (пластинка находится во влажной камере). Для ускорения этого процесса в тот же день, можно 2 - 3 раза пропускать ток через пластинку в течение 5 - 10 мин, т.е. время анализа увеличивается до 60 мин.

Использованию реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для выявления антител при менингококковой инфекции

Показания к проведению серологических исследований

РНГА с менингококковыми эритроцитарными диагностикумами серогрупп А, В и С проводят в следующих случаях:

а) как дополнительный метод диагностики менингококковой инфекции. Обязательным требованием является исследование сывороток крови от больных, взятых в разные сроки от начала заболевания, т.е. в динамике (в начале заболевания, на 7 и 15 день болезни).

б) для ретроспективного выявления локализованных форм менингококковой инфекции в очагах заболевания;

в) при проведении иммуно-эпидемиологических исследований среди населения с целью определения соотношения серонегативных и серопозитивных контингентов;

г) при оценке иммунологической эффективности противоменингококковой вакцинации.

Методика постановки РНГА с эритроцитарными менингококковыми диагностикумами

РНГА можно ставить как макро-, так и микрометодом, в последнем случае используют только микротитраторы системы "Такачи".

Различия между этими методами заключаются лишь в объемах используемых ингредиентов и сроках учета результатов реакции. При макрометоде реагирующая смесь в каждой лунке состоит из 0,5 мл соответствующего разведения сыворотки крови и 0,25 мл диагностикума. В микрометоде объемы соответственно уменьшаются: 0,05 мл сыворотки и 0,025 мл диагностикума.

Учет результатов исследования в микротитраторе проводят спустя 2 часа инкубации в термостате; при макрометоде иногда требуется дополнительная экспозиция в течение 1 - 2 часов при комнатной температуре.

При постановке РНГА можно использовать многоканальные пипетманы с указанными объемами ингредиентов.

Взятие крови

Для проведения серологических исследований кровь от больных ГФМИ или с подозрением на эту инфекцию забирают из локтевой вены с соблюдением обычных правил асептики; при массовых серологических исследованиях кровь берут из пальца.

После образования сгустка, полученную сыворотку отсасывают стерильной пипеткой в стерильную посуду (пробирку, ампулы). Хранят сыворотку крови в холодильнике при +40С. В реакции исследуют сыворотки крови без признаков пророста.

Перед постановкой РНГА сыворотки разводят 1:5 исходным буфером (ЗФР). Титрование сывороток проводят в стабилизирующем буфере.

Учет реакции

Реакцию оценивают по общепринятой 4-х плюсовой системе.

За титр противоменингококковых антител принимают максимальное разведение сыворотки крови, в котором наблюдают четко выраженную агглютинацию эритроцитов с интенсивностью не менее, чем на 2+, при условии, что в предыдущих лунках реакция шла на 4+ или 3+.

Сыворотки крови с разведения 1:5 и выше с четко выраженной агглютинацией эритроцитов, оценивают как положительные.

РНГА при генерализованных формах менингококковой инфекции

РНГА с диагностикумами А и С

Антитела к группоспецифическим полисахаридам менингококков серогрупп А и С при ГФМИ можно выявить уже в первые дни болезни.

Число серопозитивных лиц среди взрослых больных составляет в эти сроки около 40%. Максимальный уровень антител отмечается на 2 - 3-ей неделях болезни, с 4 - 5 недели уровень антител постепенно снижается.

За условно-диагностический титр антител к полисахаридам менингококков серогрупп А и С у детей старше 3-х лет и взрослых принимают положительную реакцию в разведении сыворотки крови 1:40 - 1:80, т.к. у лиц, не инфицированных менингококками в момент обследования, антитела в таких титрах встречаются сравнительно редко (9-11%).

У детей в возрасте до 1 года продукция антител выражена слабо, в связи с чем положительные реакции наблюдаются обычно в более поздние сроки (со 2 недели болезни).

У детей моложе 3-х лет за условно-диагностический титр антител к полисахаридам А и С принимают положительную реакцию в разведении 1:20 и выше, т.к. при отсутствии менингококковой инфекции у детей этого возраста антитела или не обнаруживаются, или встречаются в единичных случаях в титрах не выше чем 1:5 - 1:10.

Интенсивность антителообразования не одинакова при различных клинических формах менингококковой инфекции. При менингококцемии и сочетанных формах (менингококцемия + менингит) уровень антител обычно выше, чем при других формах болезни.

При тяжелом течении ГФМИ и особенно при инфекционно-токсическом шоке противоменингококковые антитела обнаруживаются в низких титрах, а в отдельных случаях не выявляются вообще. При очень тяжелом течении болезни особенно при наличии тяжелых осложнений (отек и набухание мозга) антителообразование выражено слабо: в остром периоде болезни обнаруживают около 10% серопозитивных проб с низкими титрами (1:5 - 1:10). В дальнейшем, при улучшении состояния больных титры антител и число серопозитивных проб может возрастать.

Обнаружение уже на 1 неделе болезни антител к полисахаридам менингококков серогрупп А и С в титре 1:160 и выше подтверждает менингококковую этиологию заболевания. В некоторых случаях такие титры антител, обнаруженные на 1 неделе болезни, могут сохраняться и в более поздние сроки заболевания. Хотя у данных больных не наблюдается сероконверсии, высокие показатели РНГА могут служить достаточным основанием для серологического подтверждения диагноза ГФМИ.

Диагноз ГФМИ определяется как этиологически подтвержденный при наличии динамики (четырехкратного и более) нарастания уровня антител. При двукратном нарастании титра антител - диагноз оценивается как подтвержденный лишь при выраженной клинической картине.

Число этиологически подтвержденных случае в ГФМИ методом РНГА может достигать: у взрослых 80%, у детей, в среднем 70% (в возрастной группе детей до 3-х лет - 60%, в старших возрастных группах - 80%).

РНГА с диагностикумом серогруппы В

При интерпретации серологических данных, полученных при работе с эритроцитарным диагностикумом на основе полисахарида менингококков серогруппы В, необходимо учитывать следующие моменты.

Изучение иммуноструктуры населения с помощью РНГА с диагностикумом серогруппы В представляет определенные сложности из-за сходства химической структуры В-полисахарида менингококка и капсульного полисахарида Е.coli K1. Существует возможность наличия перекрестных реакций, что усложняет интерпретацию результатов относительно менингококка серогруппы В. Диагностикум может быть использован для подтверждения диагноза ГФМИ при исследовании сывороток крови в динамике - взятой в начале заболевания и через 2, 3 недели.

Генерализованные формы менингококковой инфекции, обусловленные менингококками серогруппы В, наиболее часто (до 60%) диагностируются у детей первых трех лет жизни, у которых антителообразование выражено слабо. При ГФМИ у взрослых, в большинстве случаев, в первые дни болезни уровень антител к менингококкам серогруппы В составляет 1:20 - 1:40, с последующей сероконверсией на 2 - 3 неделях. В отдельных случаях (14%) содержание антител на 2 - 3 неделях болезни может достигать титров 1:640 - 1:1280 и выше.

Групповая специфичность РНГА

При постановке РНГА с набором эритроцитарных диагностикумов может выявляться одновременное присутствие антител к нескольким полисахаридам. В таких случаях серогруппу менингококков, вызвавших заболевание у данного больного, определяют по динамике нарастания уровня антител к одному из полисахаридов. При этом разница показателей парных сывороток должна быть не меньше чем на два разведения. При получении одинаковых титров антител к двум полисахаридам в условно-диагностических титрах, диагностируется ГФМИ без установления серогруппы возбудителя.

РНГА при локализованных формах менингококковой инфекции (назофарингит и бактерионосительство)

При локализованных формах менингококковой инфекции серологические исследования не следует рассматривать как метод диагностики, поскольку вопрос о носительстве или менингококковом назофарингите решается на основании бактериологического обследования. Но в ряде случаев при проведении исследований в очагах ГФМИ серологические данные могут послужить дополнительным тестом, ретроспективно подтверждающим клинико-эпидемический диагноз менингококковой инфекции. При этом следует проводить обязательное исследование парных образцов сывороток крови, полученных с 10 - 14 дневным интервалом.

При назофарингите антителообразование более выражено, чем при бактерионосительстве. У больных назофарингитом менингококковой этиологии в 90% случаев выявляются противоменингококковые антитела, в 50% случаев с титрами от 1:40 и выше. Среди бактерионосителей независимо от серогруппы выделенного возбудителя специфические антитела определяют в 65% случаев, а с титрами от 1:40 и выше у 30% носителей.

В сыворотках крови, полученных от носителей, так же как и от больных, могут выявляться антитела к нескольким полисахаридам менингококков. Нарастание антител к гомологичной серогруппе чаще отмечают при носительстве менингококков серогруппы А. В отдельных случаях динамика антител (сероконверсия) не позволяет серологически установить доминирующую серогруппу менингококков. В этом случае определяют носительство без установления серогруппы.

РНГА при иммуно-эпидемиологических исследованиях

Целью иммуно-эпидемиологических исследований является определение числа лиц вероятно восприимчивых к менингококковой инфекции и групп риска. Анализ проводят по числу серопозитивных и серонегативных лиц с учетом существующей эпидемической ситуации.

Например, в период эпидемического неблагополучия увеличивается число серопозитивных лиц и соответственно уменьшается число серонегативных к эпидемической серогруппе менингококков. В период спорадической заболеваемости, наоборот, растет число серонегативных лиц.

При проведении иммуно-эпидемиологических исследований среди населения объем репрезентативных выборок устанавливается эпидемиологом в соответствии с численностью и возрастным составом коллектива, района, населенного пункта.

Определяемый фоновый уровень противоменингококковых антител связан с заболеваемостью менингококковой инфекцией на данной территории и уровнем носительства. Наиболее высокий уровень антител в разные эпидемические периоды определяют к менингококкам серогруппы В, что, возможно, отражает их серологическое родство с E.coli K1, моракселлой, непатогенными нейссериями. При этом число серопозитивных проб с титрами антител 1:20 и выше может достигать 90%.

К менингококкам серогруппы С уровень антител наименьший, число серопозитивных сывороток с титром антител 1:20 и выше составляет 8%.

Уровень антител к менингококкам серогруппы А дает достаточно четкую характеристику эпидемиологической ситуации и отражает широту циркуляции возбудителя.

Анализ серологических результатов эпидемиологических исследований проводят на основании расчета следующих показателей:

а) процента серонегативных проб, полученных с каждым из эритроцитарных диагностикумов (А, В и С), который может отражать число вероятно восприимчивых лиц к менингококковой инфекции;

б) процента серопозитивных проб (все серопозитивные сыворотки крови, начиная с разведения 1:5 и выше), из числа которых выделяют пробы с титрами антител:

- в возрастной группе до 3-х лет с 1:10 и выше к полисахаридам А и С, с 1:20 и выше к полисахариду В;

- в старших возрастных группах у детей и у взрослых с 1:20 и выше к полисахаридам А и С, с 1:80 и выше к полисахариду В. Процент сывороток крови с указанными выше уровнями антител отражает доминирующие на данной территории серогруппы менингококков.

Применение РНГА для оценки эффективности вакцинопрофилактики менингококковой инфекции

Формирование поствакцинального иммунитета носит группоспецифический характер. В связи с этим, в зависимости от используемой для профилактики менингококковой вакцины, серологические исследования для оценки эффективности вакцинации проводят с применением РНГА с гомологичным эритроцитарным диагностикумом.

При вакцинации взрослых специфические противоменингококковые антитела к полисахариду А выявляют в высоких титрах (1:40 - 1:640 и выше) не менее чем у 80% привитых уже на 3 - 4 неделе после вакцинации. На протяжении последующих 6 - 8 месяцев у привитых титры антител несколько снижаются, но сохраняются на повышенном уровне не более двух лет.

Современные методы генодиагностики гнойных бактериальных менингитов

Современные методы генодиагностики гнойных бактериальных менингитов основаны на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Принцип ПЦР заключается в многократной амплификации генетического материала, содержащегося в исследуемом образце, с помощью фермента термостабильной ДНК-полимеразы. При генодиагностике ГБМ в качестве образца используются исходно стерильные жидкости организма человека, в первую очередь, спинномозговая жидкость. Размножению и идентификации подвергают фрагменты генома возбудителей ГБМ, то есть менингококков, пневмококков, гемофильной палочки.

Генотипирование предполагает более детальную характеристику амплифицированных участков генома с помощью ряда методик.

По сравнению с традиционными методами диагностики, генодиагностика с использованием амплификационных технологий отличается высокой чувствительностью и позволяет использовать для диагностики образцы, в которых не содержится живых возбудителей, но только фрагменты их генетического материала.

Результаты генотипирования характеризуются большей однозначностью по сравнению с морфологическими, биохимическими или иммунологическими методами классификации микроорганизмов и предоставляют непосредственную информацию для выяснения эволюционных и эпидемиологических связей различных изолятов бактерий.

Общие сведения и принципы

Геномная ДНК возбудителей ГБМ представляет собой достаточно крупную кольцевую хромосому, так, например, генома N.meningitidis состоит из 2.3 миллиона пар оснований и около 2160 генов. Функции многих генов еще неизвестны, однако среди них можно выделить уникальные участки, специфичные для данного рода, вида иди подвида микроорганизмов. Собственно генодиагностика и заключается в том, чтобы размножить и опознать подобный участок, что может быть сделано с помощью ПЦР.

Принцип ПЦР был описан в 1986 г. В основе этого метода лежит многократное копирование с помощью фермента ДНК-полимеразы определенного фрагмента ДНК.

Комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках – коротких двунитевых участках. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК используют затравки, представляющие собой специально синтезированнные in vitro олигонуклеотиды длиной около 20 - 30 оснований, называемые праймерами.

Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах амплифицируемого фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК, осуществляемый ДНК-полимеразой, протекает между ними. Процесс амплификации заключается в повторениии циклов, состоящих из денатурации ДНК, отжига праймеров и синтеза фрагмента ДНК, проходящих при различной температуре, и проводится на приборе с программным контролем температурного режима - термоциклере. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2n, где n - число циклов амплификации. После 30 - 35 циклов амплификации синтезируется 108 копий фрагмента - ампликонов, что делает возможным определение и визуализацию их электрофоретической подвижности в агарозном или акриламидном геле. Праймеры, определяющие специфичность ПЦР, могут быть строго видоспецифичными или с их помощью можно выявить целые роды микроорганизмов.

Показания к применению метода

Показания к применению нового метода начинаются там, где возникают противопоказания к применению классических методов. Идентификация патогена путем микробиологического культивирования из образцов спинномозговой жидкости или крови больного, оставаясь "золотым стандартом" диагностики, имеет серьезные ограничения, обусловленные применением антибиотиков на догоспитальном этапе. Согласно Приказу № 375 МЗ РФ "…на дому следует ввести разовую дозу пенициллина, а при тяжелой менингококцемии предпочтительнее введение левомицетина-сукцината". Подобная практика улучшает прогноз заболевания, но резко снижает число образцов СМЖ, пригодных для микробиологического и последующего эпидемиологического анализа.

В последние годы около половины больных ГБМ, поступавших в инфекционную клиническую больницу получали антибиотики на догоспитальном этапе; при этом в группе больных, получавших антибиотики на дому, летальность была менее 5%, а культуру бактерий из СМЖ (или крови) удавалось получить лишь в 30% случаев; напротив, в группе больных, не получивших антибиотики, летальность была выше 10%, а культуру бактерий получали как минимум в 60% случаев. Кроме того, бактериологическая диагностика занимает не менее суток. Таким образом, ситуация требует разработки и применения "некультуральных" методов идентификации возбудителей ГБМ.

Известным "некультуральным" методом выявления антигенов возбудителей ГБМ является метод латекс-агглютинации (ЛА) с применением соответствующих коммерческих тест-систем. Латексные частицы, покрытые специфическими антителами к антигенам Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae или Haemophilus influenzae, агглютинируют в присутствии бактериальных антигенов, содержащихся в СМЖ; результат агглютинации оценивается визуально. Постановка всей реакции занимает около 10 мин, реакция не требует наличия живых бактерий в СМЖ. Однако чувствительность метода ЛА сравнительно невысока, порядка 70%, что не удивительно, поскольку минимально определяемая концентрация бактерий в СМЖ методом ЛА составляет от 105 до 5*106 бактерий/мл или от 1 до 50 нг антигена/мл. При этом стоимость тест-систем в пересчете на одну диагностическую реакцию не менее $8.

Основные достоинства ПЦР:

· возможность выявления даже нескольких копий генома бактерий в образце и, как следствие; максимальная диагностическая мощность;

· чувствительность и специфичность, достигающие 100%, высокая воспроизводимость;

· сжатые (в течение нескольких часов) сроки исследования;

· умеренная и постоянно снижающаяся себестоимость (от 100 рублей на одну

· реакцию).

Показаниями к генодиагностике ГБМ являются:

· отрицательные результаты диагностики иными методами;

· использование для диагностики образцов СМЖ, взятых после антибиотикотерапии или на поздних стадиях болезни;

· необходимость срочного диагностического результата;

· замещение дорогостоящих иммунологических методов.

Прямых противопоказаний к применению генодиагностики ГБМ не существует. Однако, с одной стороны, ПЦР способна выявить малейшее бактериальное загрязнение тестируемого образца и рабочих растворов; с другой стороны, в ряде биологических жидкостей, в том числе, СМЖ возможно присутствие ингибиторов ПЦР. Поэтому только использование при постановке реакции положительных и отрицательных контролей, высокое и периодически проверяемое качество всех используемых реагентов, аккуратность выполнения исследования позволяют избежать как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов.

Выделение ДНК

Основное необходимое оборудование и расходные материалы:

1) настольный бокс с бактерицидной лампой ("Циклотемп", СП "РТС");

2) термостат для пробирок типа “эппендорф” на 25-1000С ("Биоком");

3) микроцентрифуга до 12-16 тыс. g. ("Elmi", "Hettish");

4) центрифуга /вортекс (“"Биоком");

5) набор автоматических пипеток переменного объема («Биоком»);

6) одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для пипеток переменного объема, одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки на 1,5 мл («Биоком», «Хеликон»);

7) отдельный халат и одноразовые перчатки. Аналогичное оборудование и материалы общелабораторного назначения понадобится и на следующих этапах.

ДНК из бактериальной суспензии выделяется стандартными методами лизиса/сорбции/отмывания (например, с использованием наборов “ДНК-сорб”, ЦНИИ эпидемиологии) или фенол-хлороформной экстракции. Концентрации ДНК в пробе при необходимости можно определить спектрофотометрически при длине волны 260 нм. Число микроорганизмов, эквивалентных данной концентрации ДНК, рассчитывается исходя из приблизительного соотношения: 1 бактериальная клетка содержит 4 фемтограмма ДНК.

Образцы СМЖ можно использовать в реакции амплификации непосредственно; перед исследованием проба (100 мкл СМЖ, покрытые сверху 100 мкл минерального масла) инкубируется в термостате для микропробирок 20 минут при 990С для разрушения бактерий, после чего центрифугируется при 10000 g в течение 1 минуты при комнатной температуре и супернатант отбирается для постановки ПЦР. Концентрацию и чистоту ДНК в подобной пробе можно повысить, добавив этап выделения путем сорбции. При этом, чтобы убедиться, что в каждом образце СМЖ выделение ДНК прошло успешно, в образец СМЖ пред выделением ДНК добавляется внутренний контроль - препарат ДНК, например, вируса гепатита В (HBV), а также приготовляется дополнительная пробирка без СМЖ, но с HBV, которая представляет собой отрицательный контроль выделения. В дальнейшем для каждого образца СМЖ ставится реакция на выявление ДНК HBV, которая должна дать положительные результаты.

Анализ и учет результатов

Продукты амплификации выявляются и дифференцируются методом электрофореза в 1.8% агарозном геле, содержащим бромистый этидий, с дальнейшей визуализацией геля при подсвечивании ультрафиолетовым излучением. Длина амплифицированного фрагмента гена 16S РНК Neisseria – 341 пар нуклеотидов, Haemophilus - 516 п.н., Streptococcus– 792 п.н., длина специфических ампликонов N. meningitidis серогруппы А – 349 п.н., группы В – 539 п.н., С- 209 п.н.. Фиксацию, хранение и анализ полученных изображений гелей удобно проводить с помощью специализированных систем обработки изображения (Gel-Doc, БиоРад; BioTest, ЦНИИ эпидемиологии); однако при небольшом объеме исследований возможна и непосредственная визуальная оценка и/или фотографирование результатов.

Ожидаемый эффект от внедрения метода

Эффективность использования метода складывается из нескольких компонентов:

Во-первых, ПЦР позволяет диагностировать в два с половиной раза больше случаев менингококкового менингита и в два раза больше случаев пневмококкового менингита по сравнению с культивированием.

По сравнению с методом ЛА, ПЦР можно выявить в два раза больше случаев менингококкового менингита и в 1.4 раза больше случаев пневмококкового менингита. В случае менингита, вызываемого гемофильной палочкой типа b, эффективность ПЦР и ЛА приблизительно одинаковы, что вероятно объясняется большим накоплением бактериального антигена в СМЖ при данной патологии. Во-вторых, сроки ПЦР-диагностики составляют 3-4 часа, а микробиологической диагностики – более суток.

В-третьих, себестоимость микробиологической диагностики, дополненной методом ЛА, - не менее 500 руб. на одного пациента, а себестоимость ПЦР-диагностики бактериальных инфекций в условиях ЦННИ эпидемиологии - менее 50 руб.

Клинические подходы к терапии менингитов различной этиологии не совпадают, поэтому своевременная дифференциальная диагностика является важным элементом эффективного лечения. Кроме того, расширенное серогруппирование менингококков позволяет при определенной ситуации принять решение о выборочной или массовой вакцинации населения.

Задачи

Идентификация и классификация бактерий, вызывающих инфекционные заболевания, относятся к числу ключевых задач как прикладной, так и фундаментальной микробиологии и эпидемиологии.

Эпидемиолог должен быть готов ответить на два достаточно различных типа вопросов:

1) Являются ли штаммы изолированные в конкретном очаге заболевания идентичными, генетически родственными или не взаимосвязанными? Это задача краткосрочного и локального эпидемиологического расследования. Результатом такого расследования должно стать устранение возбудителя инфекции из окружающей среды, определенных продуктов и других источников инфекции, включая людей.

2) Как связаны штаммы, циркулирующие на данной территории, со штаммами, распространенными на других территориях или в другие годы? Это задача долгосрочного и глобального эпидемиологического анализа. Итогом анализа должно стать выяснение закономерностей распространения, циркуляции и эволюции патогенных штаммов и клонов и создание методов эпидемиологического надзора и прогноза, учитывающих эти закономерности.

Сроки выдачи ответов и их формулировка

При бактериологическом обследовании ликвора и крови сроки выдачи и формулировка ответов таковы:

На 1-й день на основании прямой бактериоскопии ликвора и толстой капли крови дают предварительный ответ, в зависимости от результата формируется в трех вариантах:

а) при наличии в мазках большого числа морфологически типичных бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии обнаружены грамотрицательные кокки (или грамположительные палочки), сходные по морфологии с менингококками, или пневмококками, или H.influenzae. Исследование продолжается";

б) при наличии в мазках единичных бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии обнаружены единичные (или парные) клетки кокков (или палочек и т.д.). Исследование продолжается";

в) при отсутствии каких-либо бактериальных клеток пишут: "В спинномозговой жидкости (крои) при прямой бактериоскопии бактерий не обнаружено".

На основании результатов серологических реакций (ВИЭФ, ЛА и др.) ликвора дают ответ, который в зависимости от результатов формулируют следующим образом:

а) при выявлении специфического антигена пишут: "В спинномозговой жидкости выявлен специфический антиген (менингококквый, пневмококковый и H.influenzae тип "В" и др.)\";

б) при отрицательном результате пишут: "В спинномозговой жидкости специфические антигены не выявлены".

На 2-й день выдают ответ также предварительного характера, который в зависимости от результатов бактериологического исследования формулируют следующим образом:

а) при росте бактерий, типичных по морфологическим и культуральным свойствам для нейссерий и других родов, пишут: "При прямом посеве спинномозговой жидкости (крови) получен рост нейссерий (или стафилококков, стрептококков, грамотрицательных палочек и др.). Изучение культуры продолжается";

б) при наличии четко выраженной реакции агглютинации выросшей культуры с одной из специфических сывороток и положительной бактериоскопии мазка может быть дан окончательный положительный ответ: "При исследовании спинномозговой жидкости (крови) получен рост: H.influenzae, N.meningitidis, Str.pneumoniae и др.)";

в) при отсутствии роста пишут: "При прямом посеве спинномозговой жидкости (крови) роста бактерий не обнаружено. Исследование продолжается."

На 3-й день на основании культурально-биохимический свойств бактерий, отсеянных с чашки на 2-й день, выдают окончательный ответ: "Из спинномозговой жидкости (крови) выделена культура менингококков серогруппы А, В и т.п. (или негруппируемая)". В редчайших случаях "M.catarrhalis или непатогенные нейссерии".

В этот же день может быть дан предварительный ответ о росте (или его отсутствии) бактерий в результате высева из среды обогащения. Формулировка та же, что и при оценке результатов прямого посева с чашки. В этот же день выдают окончательный положительный ответ на пневмококки, который формулируют: "Из спинномозговой жидкости (крови) выделена культура Str.pneumoniae".

На 4-й день может быть выдан окончательный положительный ответ о видовой принадлежности нейссерий, выросших при прямом посеве, а также других бактерий.

На этом же этапе, как и в следующие дни (вплоть до 5-го дня), может быть выдан окончательный положительный ответ, полученный в результате высева из Среды обогащения. Формулировка та же.

Окончательный отрицательный ответ выдают не ранее 5-го дня, когда при последнем высеве из среды обогащения (на 5-й день ее инкубации) не обнаруживают роста бактерий. Его формулировка: "При инкубации спинномозговой жидкости (крови) на среде обогащения в течение 5 дней бактерий выделить не удалось".

При бактериологическом исследовании отпечатков-мазков из петехий больного или кусочков трупного материала дают предварительный ответ, который в зависимости от результатов формулируется в трех вариантах.

Окончательный отрицательный ответ выдается не ранее 5-го дня с момента посева исследуемого материала.

При бактериологическом исследовании слизи из носоглотки выдают только окончательные ответы. Сроки выдачи и формулировки следующие: на 4-й день при выделении культуры менингококка выдают положительный ответ: "В носоглоточной слизи обнаружены менингококки определенной серогруппы или негруппируемые".

В случаях добавочного отсева колоний с чашек, а также при использовании полужидкой среды обогащения сроки выдачи ответа соответственно отодвигаются на сутки. При отсутствии роста менингококков в посевах выдают отрицательный ответ: "В носоглоточной слизи менингококк не обнаружен".

Заключение

Из-за полиэтиологичности возбудителей вопросы эпидемиологии и профилактики бактериальных менингитов неоднозначны и зависят от вида возбудителя, вызвавшего менингит. В этой связи основополагающей составляющей в надзоре за бактериальными менингитами является микробиологический мониторинг, позволяющий определять их этиологическую структуру на каждой конкретной территории за определенный временной период. Этиологическую расшифровку следует рассматривать как важное противоэпидемическое мероприятие, которое обеспечивает:

· правильное и своевременное проведение этиотропной терапии, а, следовательно, снижение инвалидизации и летальности;

· адекватное использование вакцинных препаратов в соответствии с антигенными особенностями возбудителя;

· оценку значимости той или иной бактериальной флоры в этиологии бактериальных менингитов за конкретный период времени и решение вопроса поиска путей и перспектив борьбы с определенной формой менингита.

В этой связи является очевидным, что только рационально организованная, комплексная, современная лабораторная диагностика бактериальных менингитов любой этиологии позволит достоверно контролировать состояние этой инфекционной патологии и значительным образом снижать трагическое влияние бактериальных менингитов на популяцию людей.

Список использованных источников

1. Практическое руководство по антимикробной химиотерапии./ Под ред. Страчунского Л.С., Белоусова Ю.Б., Козлова С.Н. - М., Изд-во "Боргес". - 2002. - 384с.

2. Яковлев С.В. Бактериальные менингиты в отделении интенсивной терапии. - 2001. - Т. 3.,- 11.

3. Королева И.С. Менингококковая инфекция и гнойные бактериальные менингиты. МИА – Москва, 2007. Стр: 112.

4. Покровский В.И. Генодиагностика бактериальных менингитов и генотипирование их возбудителей. 2001г.

5. Методические указания МУК 4.2.1887-04 "Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов";

6. Приказ 375 О мерах по усилению эпидемиологического надзора и профилактики менингококковой инфекции и гнойных бактериальных менингитов от 23 декабря 1998 г.

Страницы: 1, 2

Рефераты

Реферат: Гнойный бактериальный менингит. Микробиологическая диагностика

Использованию реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для выявления антител при менингококковой инфекции

Рекомендуемые сроки, кратность обследования и трактовка серологических результатов

РНГА при генерализованных формах менингококковой инфекции

Показания к применению метода