В настоящее время во всем мире наблюдается значительный рост сельскохозяйственной отрасли. Это связано с рядом достаточно разнообразных факторов, среди которых:

- Постепенное истощение природных ресурсов и энергоносителей (газ, нефть и пр.), а, следовательно, требуются новые виды сырья, в качестве которого себя прекрасно зарекомендовало сырье растительного происхождения - биогаз, биотопливо, спирт на растительной основе.

- Глобальное увлечение человека здоровым образом жизни, которое, в том числе, подразумевает употребление в пищу натуральных продуктов, не содержащих консервантов, химических добавок и т.д.

- В мире наблюдается тенденция возвращения человека к ведению натурального хозяйства. Человек стремится к отдалению от города, самодостаточности и полному обеспечению себя продуктами собственного труда.

Одним из наиболее актуальных применений биотехнологии в данной области является производство различных видов бактериальных удобрений, поскольку микрофлора почвы оказывает непосредственное влияние на её плодородие и, как следствие, на урожайность растений. Почвенные микроорганизмы в процессе роста улучшают структуру почвы, накапливают в ней питательные вещества, минерализуют различные органические соединения, превращая их в легко усвояемые растением компоненты питания. Для стимуляции этих процессов применяют различные бактериальные удобрения, обогащающие ризосферу растений полезными микроорганизмами. Микроорганизмы, используемые для производства бактериальных препаратов, способствуют снабжению растений не только элементами минерального питания, но и физиологически активными веществами (фитогормонами, витаминами и др.). В настоящее время наибольшее распространение в сельском хозяйстве получили такие бактериальные удобрения, как нитрагин, ризоторфин, азотобактерин, фосфобактерин. Их практическая применимость и существенная эффективность не оставляют сомнений, что подтверждается многочисленными научными исследованиями, например работой группы ученых МСХА им. Тимирязева под руководством А.Н. Постникова, исследовавших влияние биологических препаратов на рост и урожайность картофеля в средней полосе России. Выводы, сделаные этой группой, приведены в заключительной части данной работы. К настоящему моменту доказано, что применение бактериальных удобрений не только способствует повышению урожайности ценных культур, но и значительно снижает нагрузку на окружающую среду со стороны химических соединений — минеральных удобрений и средств защиты растений, что позволяет более эффективно использовать ограниченные земельные ресурсы, затрачивать меньше усилий на их восстановление.

Технология изготовления бактериальных удобрений является достаточно простой с точки зрения биотехнологии и с точки зрения аппаратного оснащения процесса, что также повышает ее экономическую ценность. В следующей главе будут подробно рассмотрены процессы изготовления наиболее распространенных и широко используемых биопрепаратов.

Глава 1. Производство бактериальных удобрений

1.1 Производство нитрагина и ризоторфина

Отечественная промышленность выпускает два вида препаратов клубеньковых бактерий: нитрагин и ризоторфин. Оба препарата производятся на основе активных жизнеспособных клубеньковых бактерий из рода Rhizobium. Эти бактерии в симбиозе с бобовыми культурами способны фиксировать свободный азот атмосферы, превращая его в соединения, легкоусвояемые растением.

Бактерии рода Rhizobium - строгие аэробы. Среди них различают активные, малоактивные и неактивные культуры. Критерием активности клубеньковых бактерий служит их способность в симбиозе с бобовым растением фиксировать атмосферный азот и использовать его в виде соединений для корневого питания растений.

Фиксация атмосферного азота возможна только в клубеньках, образующихся на корнях растений. Возникают они при инфицировании корневой системы бактериями из рода Rhizobium. Заражение корневой системы происходит через молодые корневые волоски. После внедрения бактерии прорастают внутри них до самого основания в виде инфекционной нити. Выросшие нити проникают сквозь стенки эпидермиса в кору корня, разветвляются и распределяются по клетками коры. При этом индуцируется деление клеток хозяина и разрастание тканей. В месте локализации бактерий на корне растения-хозяина образуются клубеньки, в которых бактерии быстро размножаются и располагаются по отдельности или группами в цитоплазме растительных клеток. Сами бактериальные клетки увеличиваются в несколько раз и меняют окраску. Если клубеньки имеют красноватую или розовую окраску, обусловленную наличием пигмента легоглобина (леггемоглобина) - аналог гемоглобина крови животных, то они способны фиксировать молекулярный азот. Неокрашенные ("пустые") или имеющие зеленоватую окраску клубеньки не фиксируют азот.

Бактерии, находящиеся в клубеньках, синтезируют ферментную систему с нитрогеназной активностью, восстанавливающую молекулярный азот до аммиака. Ассимиляция аммиака происходит, в основном, путем вовлечения его в ряд ферментативных превращений, приводящих к образованию глутамина и глутаминовой кислоты, идущих в дальнейшем на биосинтез белка.

Помимо критерия активности в характеристике клубеньковых бактерий используют критерий вирулентности. Он характеризует способность микроорганизма вступать в симбиоз с бобовым растением, то есть проникать через корневые волоски внутрь корня и вызывать образование клубеньков. Большое значение имеет скорость такого проникновения. В симбиотическом комплексе растение - Rhizobium бактерии обеспечиваются питательными веществами, а сами снабжают растение азотистым питанием. С вирулентностью связана и видовая избирательность, которая характеризует способность данного вида бактерий к симбиозу с определенным видом бобового растения. Классификация различных видов Rhizobium учитывает растение-хозяина, например: Rhizobium phaseoli - для фасоли, Rhizobium lupini - для люпина, сараделлы и т.д. Вирулентность и видоспецифичность взаимосвязаны и не являются постоянными свойствами штамма.

Задачей производства бактериальных удобрения является максимальное накопление жизнеспособных клеток, сохранение их жизнеспособности на всех стадиях технологического процесса, приготовление на их основе готовых форм препарата с сохранением активности в течение гарантийного срока хранения.

Отечественная промышленность выпускает два вида нитрагина: почвенный и сухой. Впервые культура клубеньковых бактерий на почвенном субстрате была приготовлена в 1911 году на бактериально-агрономической станции в Москве. В настоящее время его производство имеет ограниченное значение, так как технология довольно сложна и трудоёмка при выполнении отдельных операций. Более перспективна технология производства сухого нитрагина.

Сухой нитрагин - порошок светло-серого цвета, содержащий в 1 г не менее 9 млрд. жизнеспособных бактерий в смеси с наполнителем. Влажность не превышает 5-7%. Промышленное производство имеет типичную схему. Необходимо отметить, что важно подбирать штаммы, устойчивые к высушиванию. Для производства посевного материала исходную культуру клубеньковых бактерий выращивают на агаризованной среде, содержащей отвар бобовых семян, 2% агара и 1% сахарозы, затем культуру размножают в колбах на жидкой питательной среде в течение 1-2 суток при 28-30оС и рН 6.5-7.5. На всех этапах промышленного культивирования применяют питательную среду, включающую такие компоненты, как меласса, кукурузный экстракт, минеральные соли в виде сульфатов аммония и магния, мел, хлорид натрия и двузамещенный фосфат калия. Основная ферментация идет при тех же условиях в течение 2-3 суток. Готовую культуральную жидкость сепарируют, получается биомасса в виде пасты с влажностью 70-80%. Пасту смешивают с защитной средой, содержащей тиомочевину и мелассу (1:20) и направляют на высушивание. Сушат путем сублимации (в вакуум-сушильных шкафах). Высушенную биомассу размалывают. Производительнее высушивание в распылительных сушках, но при этом 75% клеток теряют жизнеспособность. Препараты сухого нитрагина фасуют и герметизируют в полиэтиленовые пакеты по 0.2 - 1 кг, хранят при температуре 15оС не более 6 месяцев. Семена опудривают перед посевом. Внесение нитрагина повышает урожайность в среднем на 15-25%.

Препарат клубеньковых бактерий может выпускаться и в виде ризоторфина. Впервые торфяной препарат клубеньковых бактерий был приготовлен в 30-х годах, но технология была создана в 1973-77 гг. Для приготовления ризоторфина торф сушат при температуре не выше 100оС и размалывают в порошок. Наиболее эффективным способом стерилизации является облучение его гамма-лучами. Перед стерилизацией размолотый, нейтрализованный мелом и увлажненный до 30-40% торф расфасовывают в полиэтиленовые пакеты. Затем его облучают и заражают клубеньковыми бактериями, используя шприц, с помощью которого впрыскивается питательная среда, содержащая клубеньковые бактерии. Прокол после внесения бактерий заклеивается липкой лентой. Каждый грамм ризоторфина должен содержать не менее 2.5 млрд. жизнеспособных клеток с высокой конкурентоспособностью и интенсивной азотфиксацией. Препарат хранят при температуре 5-6оС и влажности воздуха 40-55%. Пакеты могут быть весом от 0.2 до 1.0 кг. Доза препарата составляет 200 г на га. Заражение семян производят следующем образом: ризоторфин разбавляют водой и процеживают через двойной слой марли. Полученной суспензией обрабатывают семена. Семена высевают в день обработки или на следующий.

Обработка семян бобовых культур прочно вошла в мировую сельскохозяйственную практику. Крупнейшими производителями таких препаратов являются США и Австралия.

1.2 Производство азотобактерина

Азотобактерин - бактериальное удобрение, содержащее свободноживущий почвенный микроорганизм Azotobacter chroococcum, способный фиксировать до 20 мг атмосферного азота на 1 г использованного сахара. Внесенные в качестве удобрения в почву бактерии также выделяют биологически активные вещества (никотиновую и пантотеновую кислоты, пиридоксин, биотин, гетероауксин, гиббереллин и др.). Эти вещества стимулируют рост растений. Кроме того, продуцируемые Azotobacter фунгицидные вещества из группы анисомицина угнетают развитие некоторых нежелательных микроскопических грибов в ризосфере растения.

Все виды Azotobacter строгие аэробы. Чувствительны к содержанию в среде фосфора и развиваются лишь при высоком его содержании в питательной среде. Азотфиксирующая способность культуры подавляется аммиаком (вообще содержание в среде связанного азота угнетает азотфиксацию). Стимулируют процесс фиксации азота соединения молибдена.

Установлено, что при фиксации азота процесс его восстановления протекает на одном и том же синтезируемом азотобактером ферментном комплексе и лишь конечный продукт (аммиак) отделяется от фермента. Нитрогеназная азотфиксирующая система представляет собой мультиферментный комплекс, содержащий не связанное с геном железо, молибден и SH-группы.

Микробиологическая промышленность выпускает несколько видов азотобактерина: сухой, почвенный и торфяной. Технология получения сухого азотобактерина имеет много общего с технологией производства сухого нитрагина. Сухой азотобактерин - активная культура высушенных клеток азотобактера с наполнителем. В 1 г препарата содержится не менее 0.5 млрд. жизнеспособных клеток. Культуру микроорганизма выращивают методом глубинного культивирования на среде, содержащей те же компоненты, что и при культивировании клеток Rhizobium. Дополнительно вводят только сульфаты железа и марганца, а также сложную соль молибденовой кислоты, рН 5.7-6.5.

Процесс ферментации проводят до стационарной фазы развития культуры, так как в этой фазе биологически активные вещества выделяются из клетки и остаются в культуральной жидкости. Биологически активные вещества могут также полностью или частично теряться при высушивании, однако жизнеспособные клетки быстро восстанавливают способность их продуцировать. Высушенную культуру стандартизируют, фасуют в полиэтиленовые пакеты по 0.4-2 кг и хранят при температуре 15оС не более 3 месяцев.

Почвенный и торфяной азотобактерин представляют собой активную культуру азотобактера, размноженную на твердой питательной среде, и содержат в 1 г не менее 50 млн. жизнеспособных клеток. Для их приготовления берут плодородную почву или разлагающийся торф с нейтральной реакцией среды. К просеянному субстрату добавляют 2% извести и 0.1% суперфосфата. По 500 г полученной смеси переносят в бутыли емкостью по 0.5 л, увлажняют на 40-60% по объему водой, закрывают ватными пробками и стерилизуют. Посевной материал готовят на агаровых средах, содержащих 2% сахарозы и минеральные соли. Когда агар полностью покрывается слизистой массой коричневого цвета, полученный материал стерильно смывается дистиллированной водой и переносится на приготовленный субстрат. Содержимое бутылок тщательно перемешивают и термостатируют при 25-27оС. Культивирование продолжают до тех пор, пока бактерии не размножатся до необходимого количества. Полученный препарат сохраняет свою активность в течение 2-3 месяцев.

Использовать азотобактерин рекомендуется только на почвах, содержащих фосфор и микроэлементы. Азотобактерин применяют для бактеризации семян, рассады, компостов. При этом урожайность увеличивается на 10-15%. Семена зерновых опудривают сухим азотобактерином из расчета 100 млрд. клеток на 1 гектарную порцию семян. Картофель и корневую систему рассады равномерно смачивают водной суспензией бактерий. Для получения суспензии 1 гектарную норму (300 млрд. клеток) разводят в 15 литрах воды. При обработке почвенным или торфяным азотобактерином семена перемешивают с увлажненным препаратом и для равномерного высева подсушивают. Корневую систему рассады смачивают приготовленной суспензией.

1.3 Производство фосфобактерина

Фосфобактерин - бактериальное удобрение, содержащее споры микроорганизма Bacillus megaterium var. phosphaticum. Представляет собой порошок светло-серого или желтоватого цвета.

Бактерии обладают способностью превращать сложные фосфорорганические соединения (нуклеиновые кислоты, нуклеопротеиды и т.д.) и трудноусвояемые минеральные фосфаты в доступную для растений форму. Кроме этого бактерии вырабатывают биологически активные вещества (тиамин, пиридоксин, биотин, пантотеновую и никотиновую кислоты и др.), стимулирующие рост растения. Фосфобактерин относится к числу препаратов со стимулирующим эффектом.

Bacillus megaterium var. phosphaticum представляют собой мелкие, грамположительные аэробные спорообразующие палочки размером 2*6 мкм. Клетки содержат значительное количество соединений фосфора. В ранней стадии развития это подвижные одиночные палочки, при старении образуют эндоспоры, локализующиеся в одном из концов клетки. В силу вышеизложенного технология выращивания сводится к получению спор.

В целом производство фосфобактерина похоже на производство азотобактерина и препаратов клубеньковых бактерий. Состав питательной среды в процентах: кукурузный экстракт -1.8, меласса - 1.5, сульфат аммония - 0.1, мел - 1, остальное - вода. Культивирование ведется глубинным методом в строго асептических условиях при постоянном перемешивании и принудительной аэрации до стадии образования спор. Основные параметры проведения процесса: температура 28-30оС, рН 6.5-7.5, длительность культивирования 1.5-2 суток. Полученную в ходе культивирования биомассу клеток отделяют центрифугированием и высушивают в распылительной сушилке при температуре 65-75оС до остаточной влажности 2-3%. Высушенные споры смешивают с наполнителем. Готовый препарат должен содержать не менее 8 млрд. клеток в 1 г. Расфасовывают препарат в полиэтиленовые пакеты по 50-500 г. В отличие от нитрагина и азотобактерина фосфобактерин обладает большей устойчивостью при хранении. Фосфобактерин рекомендуют применять на черноземных почвах, которые содержат наиболее значительное количество фосфороорганических соединений. Необходим для повышения урожайности зерновых, картофеля, сахарной свеклы и др. сельскохозяйственных растений. Семена обрабатывают смесью сухого фосфобактерина с наполнителем (золой, почвой и др.) в соотношении 1:40. На 1 гектарную порцию требуется 5 г препарата и 200 г наполнителя. Клубни картофеля равномерно увлажняют суспензией спор, приготовленной из расчета 15 г препарата на 15 л воды. Урожай при этом повышается на 10%. Кроме вышеупомянутых, достаточно большое распространение получил также биопрепарат АМБ (аутохтонная микрофлора Б), представляющий собой готовое сообщество микроорганизмов, нативную микрофлору почвы, способную разлагать органические вещества, высвобождая газообразный аммиак – то есть вести процесс нитрификации или аммонификации. Препарат АМБ применяется в тех случаях, когда почва обеднена и не имеет достаточного количества нативных микроорганизмов для проведения сельскохозяйственной деятельности. Кроме АМБ известен также вид препаратов ЭМ, который отличается от АМБ тем, что содержит не все почвенные бактерии подряд, а только их "элитных" представителей. В настоящее время ЭМ-препараты представляются одним из наиболее прогрессивных направлений развития биопрепаратов сельского хозяйства.

В общем, схему производства бактериальных удобрений можно свести к следующим стадиям:

1) Подбор чистой культуры бактерий и внесение ее в благоприятную среду.

2) Культивирование со значительным наращиванием биомассы.

3) Выделение и выпуск готового продукта.

Глава 2. Процесс приготовления бактериального удобрения

Рассмотрим процесс приготовления бактериального удобрения более подробно. Весь цикл состоит из 5 этапов, каждый из которых, в свою очередь, подразделяется на несколько шагов:

Схема процесса производства бактериальных удобрений в общем виде

I) Приготовление инокулята:

1) Подбор штамма бактерий, обладающего требуемыми свойствами (достаточная скорость роста, обязательно устойчивость к сухим условиям, и ряд свойств, необходимых для конечного продукта)

2) Засев на твердую питательную среду. Производится в лабораторных

3) условиях при соблюдении стерильности. Требуется для первоначального наращивания биомассы.

4) Пересев на жидкую питательную среду. Также проводится в лабораторных условиях. Необходим для получения количества биомассы, достаточного для помещения в ферментер большого объема.

II) Приготовление среды:

Этот процесс идет параллельно с приготовлением инокулята, питательная среда также используется для предварительного наращивания биомассы бактерий. Состав среды подбирается индивидуально для каждого вида бактерий. Для увеличения эффективности процесса ферментации зачастую требуется достаточно трудоемкий предварительный этап подбора оптимального состава питательной среды.

1) Подбор оптимального состава питательной среды, если требуется (при модернизации производства, при использовании нового штамма бактерий и т.д.).

2) Приготовление требуемого количества среды.

3) Стерилизация среды.

III) Ферментация:

Процесс ферментации проводится как правило глубинными методами в таре, предназначенной для конечного продукта, в помещениях, обеспеченных оптимальными для процесса условиями; реже — в ферментерах. Условия культивирования строго асептические, температурный режим как правило 26-30°С, pH среды нейтральная (6,5 — 7,5). Продолжительность культивирования зависит от требуемого количества биомассы, вида микроорганизма и других условий, в общем подбирается экспериментальным путем.

IV) Сушка:

Существует несколько методов сушки, применяемых в производстве бактериальных удобрений — сублимационная сушка, применение распылительных, ленточных и др. сушилок. Выбор метода сушки и условий процесса (температурный режим, требуемая остаточная влажность) определяются, исходя из эксплуатационных требований получаемого удобрения и того, какие микроорганизмы взяты для производства.

V) Фасовка и выпуск продукта:

Зачастую, стадия фасовки готового удобрения мало выделяется среди предшествующих стадий производства. Это связано с тем, что во многих случаях культивирование микроорганизмов производится непосредственно в товарной упаковке (например, ризоторфин — в ПЭ пакетах (предварительно в них расфасована подготовленная среда - торф), азотобактерин — в стеклянных бутылях и т.д.). Во многом это связано с тем, что срок хранения готового продукта очень недолог, поэтому экономически наиболее приемлема скорейшая его реализация. В других случаях производится сортировка, отбор, фасовка и упаковка готового продукта, для чего может потребоваться введение отдельной производственной линии.

Заключение

В заключение рассмотрим более подробно экономическую целесообразность и обоснованность внедрения производства бактериальных удобрений. По результатам их работы было установлено, что при применении азотфиксирующих бактериальных препаратов рост продуктивности картофеля за 2 года составил от 7% до 43% в зависимости от разведения препарата и сочетания его с другими бакудобрениями (конкретно были исследования силикатные бактерии). Кроме того, была обнаружена зависимость эффективности препарата от типа почвы, в которую он был внесен и глубины заделки саженцев. Немаловажным экономическим фактором так же является и то, что наибольшую эффективность препарат продемонстрировал при среднем разведении (эксперимент проводился при разведениях от 1:200 до 1:1000, при этом наивысший результат был достигнут при разведении 1:400, далее происходило снижение эффективности). Судя по всему, это связано со значительным накоплением в почве продуктов жизнедеятельности бактерий, которые нейтрализуют положительный эффект от их применения.

Из описанных результатов работы можно сделать вывод о том, что при соблюдении ряда условий, либо путем подбора более эффективных биопрепаратов, применение бактериальных удобрений в общем позволяет получать плоды, обладающие большей массой, экологичностью, безвредностью для человека и животных, и содержащие больше витаминов по сравнению с аналогами, выращенными без применения таких удобрений. Все это в итоге повышает экономичность и эффективность сельского хозяйства в целом.

В заключение рассмотрим достоинства и недостатки бактериальных удобрений как таковых. К их плюсам можно отнести следующее:

- Представляют собой 100% экологически чистые препараты

- Относительно простой производственный цикл

- Доступные штаммы микроорганизмов

- Существенная эффективность использования по сравнению с минеральными удобрениями

К недостаткам биопрепаратов можно отнести:

- Зависимость эффективности их действия от состава и свойств почвы, и ряда других факторов

- Расчет товарной упаковки на применение на больших площадях, затруднено использование на малых садовых участках

- Малый срок хранения, некоторая "сезонность" производства