Почва является основным депо разнообразных микроорганизмов на Земле [1;10]. Известно, что 60–90 % биомассы Земли представлено микроорганизмами, населяющими, главным образом почву [2], причем их численность в почве, по сравнению с другими природными средами, выше на несколько порядков [3].

Микроорганизмы распределяются по всему почвенному профилю вплоть до подстилающей породы [1;10]. Значительный практический и теоретический интерес представляет вопрос о том, как изменяется численность микроорганизмов по почвенному профилю, а также динамка численности микроорганизмов в нижнем почвенном горизонте в силу новизны самой проблемы. Особенно это касается недостаточно исследованных почв, имеющих в своем профиле оглеенные горизонты.

В анаэробных условиях при участии гетеротрофных бактерий, использующих органическое вещество, при постоянном или периодическом увлажнении идет один из интересных почвообразовательных процессов – глееобразование [2;8]. Этот процесс сопровождается восстановлением Fe(III) до Fe(II) и выносом Fe(II)-соединений в нижние горизонты почвенного профиля. Глееобразование практически всюду может происходить в результате антропогенной деятельности, если она приводит к переувлажнению почв.

В условиях застойно-промывного режима в результате глееобразования происходит максимальный вынос не только железа, но и других металлов – марганца, алюминия, кальция, магния [8;9]. Изучение особенностей микроорганизмов глеевых почв весьма актуально, так как при антропогенном воздействии на почвенный покров, в том числе при загрязнении почвы нефтью и нефтепродуктами, подобные почвы встречаются практически повсеместно. В Ярославской области почвы с различной степенью оглеения занимают около 18,3 %, что составляет 662,5 га земель [8].

Почвенные микроскопические грибы и бактерии являются практически единственными деструкторами органического вещества, поступающего в почву в виде растительного опада, мертвых животных, а также органических ксенобиотиков [4;9]. Важным микробиологическим показателем состояния почвы является соотношение численности бактерий двух физиологических групп, которые входят в функциональную структуру почвы: сапротрофов и олиготрофов [2;3]. Сапротрофы разлагают разнообразные органические соединения в значительной концентрации, попадающие в почву. Олиготрофы способны ассимилировать органические соединения в условиях их низкой концентрации, при этом они разлагают остаточные количества органических соединений, «рассеивающиеся» в почве при деятельности сапротрофов и автохтонных микроорганизмов, разлагающих почвенный гумус [1;3].

Целью работы было изучение динамики численности бактерий по почвенному профилю дерновой альфегумусовой глеевой почвы.

Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить общую численность бактерий в 5 горизонтах почвенного профиля дерновой альфегумусовой глеевой почвы путем прямого счета по методу Виноградского-Брида.

2. Определить численность сапротрофных бактерий в каждом горизонте исследуемой почвы.

3. Определить численность олиготрофных бактерий в каждом горизонте исследуемой почвы.

4. Проанализировать полученные данные по общей численности, численности сапротрофов и численности олиготрофов.

1 Материалы и методы исследования

1.1 Объект исследования и подготовка образцов почвы

к микробиологическому исследованию

Объектом исследования служили пять образцов дерновой альфегумусовой глеевой почвы, отобранной в 5 км от поселка Дорожный Ярославского района Ярославской области. Охарактеризуем горизонты по мере увеличения глубины их залегания:

1. почвенный образец взят из темногумусового горизонта почвенного разреза. Глубина 7 – 12 см, цвет темно-серый, структура зернистая, наблюдается обилие мелких корней;

2. образец взят из горизонта темногумусового с признаками оглеения почвенного разреза. Глубина 12 – 16 см, цвет темно-серый, наблюдаются мелкие серые, рыжие и сизые пятна, в качестве включений представлены мелкие корни, механический состав определяется как среднесуглинистый;

3. образец взят из светлогумусового горизонта почвенного разреза. Глубина 16 – 23 см, цвет серый, наблюдаются рыжие и сизые пятна, механический состав определяется как среднесуглинистый, структура зернисто-комковатая, в качестве включений представлены мелкие корни;

4. образец взят из иллювиально-гумусово-железистого горизонта почвенного разреза. Глубина 25 – 45 см, преобладающий цвет светло-бурый с многочисленными охристыми, сизыми и голубыми затеками и пятнами; до глубины 45 см заметны затеки гумусового вещества; горизонт плотного сложения, сильно увлажнен; механический состав определяется как легкоглинистый;

5. образец взят из глеевого горизонта почвенного разреза. Глубина 45 – 70 см, цвет темно-серый, присутствуют кирпично-красные включения; горизонт более уплотнен, с глубины 70 см просачивается вода.

Подготовку почвенных образцов проводили согласно существующим рекомендациям [7].

1. Почву высыпали на сухое стекло, тщательно перемешивали и раскладывали ровным слоем. Пользуясь пинцетом, удаляли мелкие корешки и другие посторонние включения. Из разных мест рассыпанной почвы отбирали небольшие порции и взвешивали на технических весах по 1 г почвы из каждого горизонта.

2. Для разрушения почвенных агрегатов и десорбции клеток микроорганизмов с почвенных частиц, каждую навеску почвы вносили в отдельную колбу, содержащую 100 мл стерильного физиологического раствора (0,5% раствор хлорида натрия). Колбы встряхивали на качалке в течение 30 минут.

1.2 Определение общей численности бактерий в почве

Общее количество бактерий в почве учитывали прямым счетом на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида) [6;7].

1. Пять предметных стекол обезжиривали и на каждом обводили карандашом по стеклу квадрат со стороной 15 мм.

2. Бактериальную суспензию объемом 0,1 мл из соответствующей колбы наносили на стекло и равномерно распределяли по площади квадрата.

3. Препараты подсушивали на воздухе, фиксировали в пламени спиртовки (проносили над пламенем 2 – 3 раза) и окрашивали 2 минуты фуксином. Краситель сливали, препарат промывали и высушивали между полосками фильтровальной бумаги.

4. Подсчитывали количество клеток, используя световой микроскоп марки «Биолам» с масляной иммерсионной системой при увеличении 10×1,0×100.

Для прямого счета микробных клеток вставляли в окуляр микроскопа сеточку Гаженко, 9 маленьких квадратиков которой составляют поле зрения. Просматривали 15 полей зрения.

Общую численность бактерий в 1 г почвы (Nобщ.) определяли по формуле:

S × Σni

N общ. = z× s×v ×100 [кл/г], где

S – общая площадь окрашенного на стекле препарата (225 мм2);

Σni – сумма подсчитанных под микроскопом микробных клеток;

z – количество просмотренных полей зрения (15);

s – площадь одного поля зрения (1089×10-6 мм2);

v – объем образца воды, затраченный на приготовление окрашенного препарата (0,1 мл);

100 – разведение первоначального образца почвы в 100 раз.

Опыт проводили в двухкратной повторности, чтобы рассчитать доверительный интервал.

1.3 Определение численности сапротрофов и олиготрофов

Определение количества клеток сапротрофов (Nсапр.) проводили высевом на жидкую питательную среду – мясо-пептонный бульон (МПБ) [6]. Для приготовления МПБ использовали стандартную питательную среду (ИЛО «Питательные среды»). Состав МПБ, г/л: панкреатический гидролизат кильки – 17,9; NaCl – 7,7 ± 0,3; вода дистиллированная – 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность определяли при помощи метода наиболее вероятного числа (НВЧ) с использованием таблиц Мак-Креди [7]. Готовили ряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы. Для посевов использовали разведения от 10-1 до 10-7. Количество посевного материала везде составляло 1 мл, посев осуществляли в трехкратной повторности. Инкубацию проводили в термостате при 28 0С в течение 7 сут. После инкубации регистрировали рост бактерий, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки [6;7].

Для выделения олиготрофов использовали среду М2 следующего состава [11]: Na2HPO4 – 0,8 г; KH2PO4 – 0,5 г; NH4Cl – 0,5 г; MgSO4 – 0,2 г; CaCl2 – 0,1 г; FeSO4×7H2O –15 мг; дрожжевой экстракт – 0,1 г ; пептон – 0,2 г; агар – 15 г; глюкоза – 0,2 г; вода дистиллированная – 1000 мл. Среду стерилизовали автоклавированием 20 мин при 1 атм. Численность олиготрофов (Nолиг.) определяли методом высева по Коху [7]. Готовили ряд предельных десятикратных разведений 1 г почвы в дистиллированной воде: от 10-1 до 10-9. По 1 мл суспензии из каждого разведения вносили в три параллельные чашки Петри. Все чашки заливали расплавленной средой. Посевы инкубировали 14 сут., а затем подсчитывали количество колоний, выросших на каждой чашке и среднее число колоний, выросших из одного разведения. При этом определяли значимость различий двух повторных определений по критерию χ2, рассчитываемому по формуле [7]:

(ni – n)2

χ 2 = п ,

где пi – число колоний, выросших на первой и второй чашках, засеянных из одного разведения; п – их среднее значение.

Различие считается значимым при χ 2 не менее 3,841. Пересчет числа выросших колоний (п) на численность бактерий соответствующей группы (N) производили исходя из предположения, что одной колониеобразующей единицей (КОЕ) является отдельная микробная клетка. Для этого использовали формулу:

n×r

Nолиг. = v [кл/г],

где п – среднее число колоний на чашках Петри, засеянных из одного разведения; r – величина разведения; v – объем образца, посеянного на чашку (мл).

Кроме того, рассчитывали отношение Nсапр. к Nобщ. для каждого горизонта.

2 Результаты и обсуждение исследования

Результаты начального этапа микробиологического исследования почвенных образцов представлены в приложении 2 и на рисунке 1.

Таблица 1

Общая численность бактерий в почвенном профиле

дерновой альфегумусовой глеевой почвы

Горизонты (расположены от верхнего к нижнему)	Численность бактерий, кл/г сухой почвы
1.	(5,35±0,05)×109
2.	(6,2±0,1)×109
3.	(4,8±0,15)×109
4.	(4,5±0,05)×109
5.	(3,65±0,1)×109

Рис. 1. Динамика общей численности бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы. N – численность бактерий

(× 109 кл/г почвы).

Как видно из табл. 1 и рис. 1, максимальное значение общей численности бактерий (Nобщ.) – 6,2×109 кл/г – наблюдали во втором горизонте, по сравнению с остальными четырьмя горизонтами. Этот факт можно объяснить тем, что два верхних горизонта исследуемой почвы обладают хорошей проницаемостью для воды и поступающего с ней органического вещества. Третий горизонт почвенного профиля уже более уплотнен, поэтому органическое вещество, накапливаясь во втором горизонте, является фактором, стимулирующим развитие в нем почвенных микроорганизмов.

Данные табл. 1 показывают, что Nобщ. достоверно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта: от второго к пятому, самому нижнему. Полученный результат согласуется с тем фактом, что содержание органического вещества, необходимого для развития почвенных микроорганизмов, также снижается с увеличением глубины залегания горизонта. При переходе от верхнего горизонта к нижележащим изменяются также окислительно-восстановительные условия, pH и др.

Порядок величин Nобщ. в каждом горизонте был одинаков – 109 кл/г. По-видимому, в верхних более рыхлых горизонтах, куда поступает достаточное количество кислорода с поверхности, создались оптимальные условия для развития аэробных микроорганизмов. В нижележащих горизонтах содержание кислорода минимально, и прежний порядок значения Nобщ. объясняется активным развитием анаэробов.

Численность сапротрофных бактерий (Nсапр.) уменьшалась от первого горизонта к третьему, причем резкое снижение численности – более чем в 6 раз – было отмечено при переходе от первого ко второму горизонту (рис. 2А). Nсапр. (таб.2) в четвертом горизонте – 4,5×104 кл/г – была незначительно выше, по сравнению с третьим – 2,0×104 кл/г, – тогда как в пятом она опять понижалось до значения, отмеченного в третьем горизонте (рис. 2А). Как показано на рис. 2Б, численность олиготрофных бактерий (Nолиг.) последовательно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта от 9,5×107 в первом до 1,5×107 кл/г в пятом горизонте (таб.2).

Рис. 2. Численность сапротрофов (А) и олиготрофов (Б) в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы. N – численность бактерий (кл/г почвы)

Таблица 2

Численность сапротрофных и олиготрофных бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы

Горизонт	Сапротрофы	Олиготрофы
1	2,5×105	9,5×107
2	4,0×104	7,5×107
3	2,0×104	3,5×107
4	4,5×104	2,0×107
5	1,4×104	1,5×107

В общем, Nсапр. находилась на уровне 105 кл/г в первом, и 104 кл/г в остальных горизонтах (прил. 3). Nолиг. соответствовала 107 кл/г в каждом горизонте профиля. Таким образом, Nолиг. была меньше, чем Nсапр.: в первом горизонте в 100, а в остальных четырех – в 1000 раз. Выявленное значительное преобладание олиготрофов над сапротрофами свидетельствует о том, что в исследованной почве низкое содержание легкоразлагаемой органики [2], следовательно, данная почва не подвергалась антропогенному загрязнению. Бактерии функционируют в ней за счет органического вещества самой почвы. Сапротрофы, развивающиеся в условиях высокой концентрации органики [3;4], уже переработали ее большую часть. В настоящее время в исследованной почве доминируют олиготрофы, которым для существования необходимо низкое содержание органики в среде [2;4].

Интересным является факт, что для горизонтов с четвертого по пятый отмечаются признаки оглеения почвы – сизые и голубые пятна и затеки. В настоящее время известны три совокупные причины глеегенеза [5]: 1) высокая влажность; 2) наличие легкоразлагаемого органического вещества в избыточном количестве; 3) жизнедеятельность гетеротрофных микроорганизмов. Согласно нашим результатам, процесс глеегенеза идет в исследуемой почве при доминировании в микробоценозе олиготрофных бактерий, а, следовательно, в отсутствие избытка органического вещества.

Отношение Nсапр. к Nобщ. составило величины порядка 10-4 – 10-5 (табл.3), что свидетельствует о климаксном состоянии микробоценоза [3] и о доминировании бактерий, которые получают необходимые питательные вещества и энергию за счет использования трудноразлагаемых органических веществ почвы в течение длительного времени.

Таблица 3

Отношение общей численности к численности сапротрофных бактерий в почвенном профиле дерновой альфегумусовой глеевой почвы

Горизонты (расположены от верхнего к нижнему)	Nсапр. Nобщ.
1.	0,5×10-4
2.	0,6×10-5
3.	0,4×10-5
4.	1,0×10-5
5.	0,4×10-5

Примечание: Nсапр. – численность сапротрофных бактерий (кл/г); Nобщ. – общая численность бактерий (кл/г).

Заключение

1. Общая численность бактерий снижается с глубиной залегания почвенного горизонта, максимальное значение – 6,2×109 кл/г – наблюдается во втором горизонте за счет того, что два верхних горизонта исследуемой почвы обладают хорошей проницаемостью для воды и поступающего с ней органического вещества.

2. Количество сапротрофных бактерий уменьшалось от первого горизонта к третьему – от 2,5×105 до 1,4×104 кл/г, – причем резкое снижение численности – более чем в 6 раз (от 2,5×105 до 4,0×104 кл/г) – было отмечено при переходе от первого ко второму горизонту.

3. Численность олиготрофных бактерий последовательно снижалась с увеличением глубины залегания почвенного горизонта от 9,5×107 в первом до 1,5×107 кл/г в пятом горизонтах.

4. Отношение численности олиготрофных бактерий к сапротрофным для первого горизонта составляет величину порядка 102, а в остальных четырех – 103, что свидетельствует о значительном преобладании олиготрофов над сапротрофами.

5. Отношение численности сапротрофных бактерий к общей численности бактерий составляет величины порядка 10-4 – 10-5, что свидетельствует о климаксном состоянии микробоценоза и о доминировании бактерий, жизнедеятельность которых связана с использованием трудноразлагаемых органических веществ почвы.

6. Согласно нашим результатам, процесс глеегенеза идет в исследуемой почве при доминировании в микробоценозе олиготрофных бактерий, а, следовательно, в отсутствие избытка органического вещества.

Список использованных источников и литературы

1. Бабьева И.П. Биология почв / И.П. Бабьева, Г.М. Зенова. – М.: МГУ, 1989. – 336 с.

2. Емцев В.Т. Микробиология / В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. – М.: Дрофа, 2005. – 445 с.

3. Добровольская Т.Г. О показателях структуры микробных сообществ / Т.Г. Добровольская, И.Ю. Чернов, Д.Г. Звягинцев // Микробиология. – 1997. – Т.66. – №3. – С. 408–414.

4. Заварзин Г.А. Введение в природоведческую микробиологию / Г.А. Заварзин, Н.Т. Колотилова. – М.: Книжный дом «Университет», 2001. – 256 с.

5. Зайдельман, Ф.Р. Процесс глееобразования и его роль в формировании почв / Ф.Р. Зайдельман. – М.: МГУ, 1998. – 316 с.

6. Кузнецов С.И. Методы изучения водных микроорганизмов / С.И. Кузнецов, Г.А. Дубинина. – М.: Наука, 1989. – 288 с.

7. Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С. Егорова. – М: МГУ, 1976. – 307 с.

8. Соединения железа, алюминия, кремния и марганца в почвах лесных экосистем таежной зоны / М. Мурашкина, Г. Копцик, и др. // Почвоведение. – 2004. – № 1. – С. 40– 49.

9. Умаров М.М. Экология и почвы / М.М. Умаров. Избранные лекции 1–7 школ, М.: Пущино, 1998, 15–21 с.

10. Экология микроорганизмов: учебник / А. И. Нетрусов, Е.А. Бонч - Осмоловская, и др. – М.: Издательский центр «Академия», 2004. – 272с.

11. Hottes A.K. Transcriptional profiling of Caulobacter crescentus during growth on complex and minimal media / A.K. Hottes, M. McEwen, D. Yang et al. // J. Bacteriol. – 2004. – V. 186. – №5. – P. 1448–1461.